Fluorescent Antibody Technique (FAT)
Fluorescent Antibody Technique (FAT) untuk penggunaan didalam mikrobiologi telah diperlihatkan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun 1942. sebelumnya telah diperkenelkan penandaan protein antibodi dengan zat warna yang dapat berfluoresensi.
Fluoresensi merupakan pemancaran sinar oleh atom atau molekul setelah terlebih dahulu disinari. Zat warna yang dapat befluoesensi disebut fluorokrom. Pada dasarnya teknik fluoresen antibodi ini merupakan kombinasi cara-cara imunologis dan pewarnaan. Adanya antigen akan diperlihatkan dengan perantaraan antibodi yang telah disenyawakan dengan fluorkrom.
 |
| Anjing, salah satu hewan penular rabies |
Prinsip dari uji ini adalah terbentuknya ikatan antara antigen (virus rabies) dengan spesifik antibodi virus rabies yang telah dikonjugasi dengan zat fluorescen sehingga tampak agregat yang berpendar hijau (fluorescensi) pada sampel yang diamati dengan menggunakan mikroskop flurorescent. Organ target virus penyebab rabies adalah jaringan sistem syarat pusat otak, khususnya cerebellum, hipokampus, thalamus, cereberal cortex dan medulla oblongata. Hewan yang menunjukkan gejala klinis rabies atau mati akibat penyakit rabies, banyak ditemukan antigen virus rabies di dalam air liur, air mata dan jaringan otak. Dalam otak, antigen virus rabies terdapat dalam jumlah yang sangat banyak terutama pada thalamus, pons dan medulla. Organ lain seperti glandula salivarius memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang bervariasi. Jaringan yang direkomendasikan untuk dikoleksi dan diuji adalah pool dari jaringan otak dan batang otak (brain stem).
Alat -alat yang diperlukan :
a. Laminar flow cabinet,
b. Mikroskop fluoresensi (merek Olympus atau Nikon)
c. Gunting dan pinset
d. Gelas obyek atau gelas slide
e. Gelas penutup
f. Inkubator dengan suhu 37 derajat Celcius
g. Cawan petri
h. Kulkas
i. Gelas beaier
j. Pipet pasteus spuit 1 ml
Reagensia dan bahan-bahan biologik:
a. Larutan PBS pH 7,4 tanpa Ca2+ dan Mg2+, disimpan pada suhu 4°C,
b. Aseton (high grade) dingin,
c. Aqudes,
d. Larutan evans blue 1:2000
e. Buffer gliserin 50% (mounting media)
f. Konjugat anti rabies (Biored), antibodi spesifik terhadap virus rabies yang dilabeli FITC,
g. Kontrol otak positif rabies,
h. Kontrol otak negatif rabies.
 |
| Pembacaan hasil slide ulas tekan otak HPR pada mikroskop fluresen |
Prosedur kerja dan uji:
1. Buat preparat slide tekan :
a. Buat lingkaran pada gelas obyek yang akan digunakan untuk membuat preparat ulas tekan.
b. Tulis nomor atau kode spesimen
c. Letakkan sampel pada cawan petri dan potong bagian otak (hipokampus, medulla, pons) dan
letakkan pada kertas minyak.
e. Tempelkan gelas obyek pada potongan otak, dimulai dari lingkaran yang dekat dengan nomor
spesimen, lalu tekan yang kuat. Lakukan hal yang sama pada lingkaran yang satunya.
Pindahkan pada kertas towel dan tekan yang sama di atas beberapa kali agar mendapatkan
preparat tekan yang tipis. Preparat diangin-anginkan sejenak.
f. Buat sekurang-kurangnya 4 slide preparat; 2 preparat ulas (smear) dan 2 preparat tekan (gerusan)
dari sampel otak segar (mengandung dasar cerebellum, hippocampus, cortex dan medulla
oblongata) setipis mungkin pada gelas slide. Disamping itu buat slide preparat dari otak yang
mengandung virus rabies dan otak yang tidak mengandung virus rabies sebagai
pembanding/kontrol positif dan negatif.
2. Bila sampel otak telah diawetkan dalam 50% gliserin – PBS, maka preparat dicuci beberapa kali
dengan PBS untuk menghilangkan gliserol yang dapat menutupi fluoresensi
3. Preparat kemudian dikeringkan dengan cara dihembuskan angin (diangin-angin), lalu dimasukkan
ke dalam coplin jar (kontainer) yang mengandung aseton dingin (preparat terendam) dan simpan di dalam freezer -15 °C sampai -20 °C selama 30 menit.
4. Preparat kemudian diangkat dari rendaman aseton dingin lalu dikeringkan (diangin-angin),
5. Susun preparat dalam cawan petri besar yang telah dialasi kertas saring basah (untuk menjaga
kelembapan.
6. Teteskan konjugat anti rabies FITC sebanyak 1-2 tetes pada lokasi yang didemarkasi. Usahakan
cairan konjugat tersebar secara merata menutupi lokasi demarkasi.
7. Tempatkan slide preparat tadi secara horisontal pada rak yang datar di atas baki yang cukup
mengandung air, baki ditutup dan lalu ditempatkan di dalam inkubator dengan suhu 37 °C selama
30 menit.
Untuk rekomendasi: untuk memperoleh hasil yang lebih kontras dan lebih baik flourescentnya
serta mendeteksi sampel yang positif lemah, dianjurkan konjuget Biored dicampur dengan Evans
Blue 1% dengan perbandingan 0,1 ml Evans Blue 1% dicampurkan dengan 2 ml konjuget Biorad.
8. Setelah selesai masa inkubasi, slide preparat kemudian di rendam dalam PBS pH 7,4 selama 5
menit sebanyak 2 (dua) kali,
9. Slide preparat kemudian dipindahkan dan dikeringkan dengan cara menempatkannya secara
vertikal.
10. Setelah slide preparat kering, tambahkan 1 tetes 50% gliserin bufer pH 7,6 di atasnya, tutup
dengan coverslips pada lokasi yang akan diamati, lalu amati di bawah mikroskop fluorescen
dengan perbesaran 40 x.
11. Slide preparat kontrol positif dan slide preparat sampel yang mengandung virus rabies akan
berwarna fluoresen hijau terang (apple green) atau struktur hijau-kekuningan dengan ukuran
yang bervariasi mulai dari ukuran kecil ibarat seperti butiran pasir sampai ukuran besar Negri
Bodies. Tidak terlihat adanya warna fluorescen hijau terang (apple green) atau struktur hijau-
kekuningan pada slide kontrol negatif.
12. Sampel dinyatakan positif rabies jika ditemukan sel yang berpendar hijau (berwarna fluoresen
hijau terang (apple green) atau struktur hijau kekuningan), seperti dijumpai pada slide kontrol
positif tetapi tidak dijumpai gambaran tadi pada slide kontrol negatif.
 |
| Hasil positif rabies pada mikroskop flouresen |
